重组黧豆蛋白酶的制备及其活性研究

作者:王真; 吴方晖; 阴忆烽; 张毅; 刘艳丽; 宋云扬
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目的通过基因克隆、表达和纯化,获得高纯度的重组拉脱维亚蛋白酶(93~309,m),并研究其生物学活性,为研究非组胺依赖性瘙痒信号通路提供模型材料。方法 将全基因合成的编码粘蛋白活性域(93~309)的基因片段克隆到pET-28a(+)-sumo载体中,并转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达。融合蛋白his6-sumo-m经sumo蛋白酶消化后,经Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过透析复性获得重组山黧豆蛋白酶。用15%SDS-PAGE和Edman降解法分别鉴定了重组拉脱维亚蛋白酶的分子量和N端氨基酸序列。采用flip检测技术对重组山黧豆蛋白酶的生物活性进行了分析。结果获得纯度为90%的重组山黧豆蛋白酶,产率达到50  mg·l-1.。flip试验结果表明,与对照组相比,重组山黧豆蛋白酶可诱导HeLa细胞内钙流量发生显著而持续的变化,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64可抑制胞浆Ca2+的变化。结论通过基因克隆和表达技术,可以获得具有生物活性的重组山楂蛋白酶。